PCR, არის პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია, რომელიც ეხება dNTP, Mg2+, დრეკადობის ფაქტორების და ამპლიფიკაციის გამაძლიერებელი ფაქტორების დამატებას სისტემაში დნმ პოლიმერაზას კატალიზის ქვეშ, მშობელი დნმ-ის შაბლონად და სპეციფიკური პრაიმერების, როგორც გაფართოების საწყისი წერტილის გამოყენებით. დენატურაციის, ანეილირების, გაფართოების და ა.შ. საფეხურებით, შვილობილი ჯაჭვის დნმ-ის დამატებითი რეპლიკაციის ინ ვიტრო პროცესს შეუძლია სწრაფად და კონკრეტულად გააძლიეროს ნებისმიერი სამიზნე დნმ in vitro.
1. Hot Start PCR
გაძლიერების დაწყების დრო ჩვეულებრივ PCR-ში არ არის PCR აპარატის PCR აპარატში ჩასმა და შემდეგ პროგრამა იწყებს გაძლიერებას.როდესაც სისტემის კონფიგურაცია დასრულებულია, გაძლიერება იწყება, რამაც შეიძლება გამოიწვიოს არასპეციფიკური გაძლიერება და ცხელი დაწყების PCR შეუძლია ამ პრობლემის გადაჭრას.
რა არის ცხელი დაწყება PCR?რეაქციის სისტემის მომზადების შემდეგ, ფერმენტის მოდიფიკატორი გამოიყოფა მაღალ ტემპერატურაზე (ჩვეულებრივ 90°C-ზე მაღალი) რეაქციის საწყის გაცხელების ან „ცხელი დაწყების“ ეტაპზე, ისე, რომ დნმ პოლიმერაზა გააქტიურდეს.გააქტიურების ზუსტი დრო და ტემპერატურა დამოკიდებულია დნმ პოლიმერაზასა და ცხელი დაწყების მოდიფიკატორზე.ეს მეთოდი ძირითადად იყენებს მოდიფიკატორებს, როგორიცაა ანტისხეულები, აფინურობის ლიგანდები ან ქიმიური მოდიფიკატორები დნმ პოლიმერაზას აქტივობის დასათრგუნავად.ვინაიდან დნმ პოლიმერაზას აქტივობა ინჰიბირებულია ოთახის ტემპერატურაზე, ცხელი დაწყების ტექნოლოგია უზრუნველყოფს დიდ კომფორტს ოთახის ტემპერატურაზე მრავალი PCR რეაქციის სისტემის მოსამზადებლად PCR რეაქციების სპეციფიკის შეწირვის გარეშე.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) არის ექსპერიმენტული ტექნიკა mRNA-დან cDNA-ში შებრუნებული ტრანსკრიფციისთვის და მისი გამოყენების შაბლონად ამპლიფიკაციისთვის.ექსპერიმენტული პროცედურა არის ქსოვილებში ან უჯრედებში მთლიანი რნმ-ის ამოღება ჯერ, ოლიგოს (dT) გამოყენება, როგორც პრაიმერი, საპირისპირო ტრანსკრიპტაზის გამოყენება cDNA-ს სინთეზისთვის და შემდეგ cDNA, როგორც შაბლონი PCR გაძლიერებისთვის სამიზნე გენის მისაღებად ან გენის ექსპრესიის გამოსავლენად.
3. ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR
ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR (რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR,RT-qPCR) ეხება PCR რეაქციის სისტემაში ფლუორესცენტური ჯგუფების დამატების მეთოდს, ფლუორესცენტური სიგნალების დაგროვების გამოყენებით PCR მთელი პროცესის რეალურ დროში მონიტორინგისთვის და ბოლოს სტანდარტული მრუდის გამოყენებით შაბლონის რაოდენობრივი ანალიზისთვის.ხშირად გამოყენებული qPCR მეთოდები მოიცავს SYBR Green I და TaqMan.
4. Nested PCR
Nested PCR გულისხმობს PCR პრაიმერების ორი ნაკრების გამოყენებას PCR გაძლიერების ორი რაუნდისთვის, ხოლო მეორე რაუნდის ამპლიფიკაციის პროდუქტი არის სამიზნე გენის ფრაგმენტი.
თუ პირველი წყვილი პრაიმერების (გარე პრაიმერების) შეუსაბამობა იწვევს არასპეციფიკური პროდუქტის გაძლიერებას, შესაძლებლობა იმისა, რომ იგივე არასპეციფიკური რეგიონი ამოიცნოს მეორე წყვილი პრაიმერი და გააგრძელოს გაძლიერება, ძალიან მცირეა. პრაიმერების მეორე წყვილით გაძლიერება, PCR-ის სპეციფიკა გაუმჯობესებულია.PCR-ის ორი რაუნდის შესრულების ერთ-ერთი უპირატესობა ის არის, რომ ის ეხმარება საკმარისი პროდუქტის გაძლიერებას შეზღუდული საწყისი დნმ-ისგან.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR არის მეთოდი PCR რეაქციის სპეციფიკის გასაუმჯობესებლად PCR ციკლის პარამეტრების კორექტირებით.
Touchdown PCR-ში, ანეილირების ტემპერატურა პირველი რამდენიმე ციკლისთვის დაყენებულია პრაიმერების მაქსიმალური ანეილირების ტემპერატურაზე (Tm) რამდენიმე გრადუსით ზემოთ.უფრო მაღალი ანეილირების ტემპერატურამ შეიძლება ეფექტურად შეამციროს არასპეციფიკური გაძლიერება, მაგრამ ამავდროულად, უფრო მაღალი ანეილირების ტემპერატურა გააუარესებს პრაიმერებისა და სამიზნე თანმიმდევრობების განცალკევებას, რაც გამოიწვევს PCR-ის გამომუშავების შემცირებას.ამიტომ, პირველ რამდენიმე ციკლში, ანეილირების ტემპერატურა ჩვეულებრივ მცირდება 1°C-ით ციკლში, რათა გაიზარდოს სამიზნე გენის შემცველობა სისტემაში.როდესაც დუღილის ტემპერატურა ოპტიმალურ ტემპერატურამდე იკლებს, დუღილის ტემპერატურა შენარჩუნებულია დარჩენილი ციკლებისთვის.
6. პირდაპირი PCR
პირდაპირი PCR ეხება სამიზნე დნმ-ის გაძლიერებას უშუალოდ ნიმუშიდან ნუკლეინის მჟავას იზოლაციისა და გაწმენდის საჭიროების გარეშე.
პირდაპირი PCR-ის ორი ტიპი არსებობს:
პირდაპირი მეთოდი: აიღეთ ნიმუშის მცირე რაოდენობა და დაამატეთ იგი პირდაპირ PCR Master Mix-ში PCR იდენტიფიკაციისთვის;
კრეკინგის მეთოდი: ნიმუშის აღების შემდეგ, დაამატეთ იგი ლიზატში, გაასუფთავეთ გენომის გასათავისუფლებლად, აიღეთ მცირე რაოდენობით ლიზირებული სუპერნატანტი და დაამატეთ იგი PCR Master Mix-ში, შეასრულეთ PCR იდენტიფიკაცია.ეს მიდგომა ამარტივებს ექსპერიმენტულ სამუშაო პროცესს, ამცირებს პრაქტიკულ დროს და თავიდან აიცილებს დნმ-ის დაკარგვას გაწმენდის ეტაპების დროს.
7. SOE PCR
გენის შეერთება გადახურვის გაფართოებით PCR (SOE PCR) იყენებს პრაიმერებს დამატებითი ბოლოებით, რათა PCR პროდუქტები წარმოქმნან გადახურვის ჯაჭვები, ასე რომ, შემდგომ გაძლიერების რეაქციაში, გადახურვის ჯაჭვების გაფართოების გზით, A ტექნიკის სხვადასხვა წყაროები, რომელშიც გაძლიერებული ფრაგმენტები გადახურულია. და ერთმანეთში შერწყმული.ამ ტექნოლოგიას ამჟამად ორი ძირითადი მიმართულება აქვს: შერწყმის გენების აგება;გენის ადგილზე მიმართული მუტაცია.
8. IPCR
ინვერსიული PCR (IPCR) იყენებს საპირისპირო დამატებით პრაიმერებს ორი პრაიმერის გარდა დნმ-ის ფრაგმენტების გასაძლიერებლად და აძლიერებს უცნობ თანმიმდევრობებს დნმ-ის ცნობილი ფრაგმენტის ორივე მხარეს.
IPCR თავდაპირველად შეიქმნა მიმდებარე უცნობი რეგიონების თანმიმდევრობის დასადგენად და ძირითადად გამოიყენება გენის პრომოტორული თანმიმდევრობების შესასწავლად;ონკოგენური ქრომოსომული გადანაწილებები, როგორიცაა გენის შერწყმა, ტრანსლოკაცია და ტრანსპოზიცია;და ვირუსული გენის ინტეგრაცია, ასევე ხშირად გამოიყენება ახლა ადგილზე მიმართული მუტაგენეზისთვის, დააკოპირეთ პლაზმიდი სასურველი მუტაციით.
9. dPCR
ციფრული PCR (dPCR) არის ნუკლეინის მჟავის მოლეკულების აბსოლუტური რაოდენობრივი განსაზღვრის ტექნიკა.
ამჟამად არსებობს ნუკლეინის მჟავის მოლეკულების რაოდენობრივი განსაზღვრის სამი მეთოდი.ფოტომეტრია ეფუძნება ნუკლეინის მჟავის მოლეკულების შთანთქმას;რეალურ დროში ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR (Real Time PCR) ეფუძნება Ct მნიშვნელობას, ხოლო Ct მნიშვნელობა ეხება ციკლის ნომერს, რომელიც შეესაბამება ფლუორესცენციის მნიშვნელობას, რომელიც შეიძლება გამოვლინდეს;ციფრული PCR არის უახლესი რაოდენობრივი ტექნოლოგია, რომელიც დაფუძნებულია ერთმოლეკულურ PCR მეთოდზე, ნუკლეინის მჟავების დათვლის რაოდენობრივად არის აბსოლუტური რაოდენობრივი მეთოდი.
გამოქვეყნების დრო: ივნ-13-2023